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免疫组织化学篇一：免疫组化各步原理
一、免疫组化技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。 Slide 3:
（一）、免疫组化常用染色 方法和步骤（石蜡切片）
SP法 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法） :
SP法 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法） 原理 采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤 :
主要步骤 1、石蜡切片脱蜡 （与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中 5~10 min→二甲苯Ⅱ 5~10min →无水乙醇5min →95%乙醇5min →80%乙醇5min →70%乙醇5min →自来水洗
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2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS洗3次，每次5min。 3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。 4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色)
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5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再 4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min 。 6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育20min， PBS洗3次，每次5min。 Slide 8:
7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度， 自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。 染色步骤 :
染色步骤 石蜡切片脱蜡到水； 3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。抗原修复；PBS洗3次，每次5min；
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滴加第一抗体，37℃孵育60min或37℃孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次3min 。擦干组织周围PBS，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃, 孵育20min。 PBS洗3次，每次3min，D.W洗2次，DAB显色，镜下控制，自来水充分冲洗，复染，烤干，中性树胶封片。
（四）抗原修复 :
（四）抗原修复 目的 ： 1、 甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；
2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇；
3、固定剂固定组织时，会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，也可能封闭抗原决定簇。 4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先进行抗原修复，通过抗原修复，充分暴露抗原决定簇。使抗原抗体得以充分结合。 Slide 15:
抗原修复的作用机理是 1、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定族结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。
2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。 3、微波是一种高频电磁波，可打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。
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抗原修复注意事项 :
抗原修复注意事项 1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。 2、热处理后应注意自然冷却，酶消化后要洗干净。 3、防止切片干燥，特别是热修复时要防止修复液蒸发而使切片干燥。
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4、注意形态学结构的改变和脱片问题：酶消化浓度过高，时间过长、温度过高都可能导致组织的形态结构改变；热修复时间过长也可能导致形态学结构改变和脱片。
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（五）常用溶液的配制 1、0.01MPBS: 磷酸二氢钠(NaH2PO4) 1.5g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 14.5g 氯化钠 42.5g 氢氧化钠 2粒 加蒸馏水 5000ml Slide 24:
2 、 3%H2O2 甲 醇 450ml 30%H2O2 50ml 混匀。
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3、pH值6．0的柠檬酸缓冲液 3.1 储存液： A液：枸橼酸 21.01g 蒸馏水 1000ml B液：枸橼酸钠 29.41g 蒸馏水 1000ml
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0.1?3.2 工作液： A液 9ml B液 41ml 蒸馏水 450ml 溶液pH值 为6.0 Slide 27:
4、胰蛋白酶(0.05%~0.1% ) 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中溶解即可。
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5、胃蛋白酶（0.4%） 胃蛋白酶 0.4克 0.1mol/L HCl 100ml * 配制好的酶用5ml小瓶分装，保存于冷冻箱，用前拿出来溶解。
（六）结果观察(一) 胞浆阳性 :
（六）结果观察(一) 胞浆阳性
(二) 胞核阳性 :
(二) 胞核阳性
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二、常见问题及对策
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由于免疫组化染色过程有许多步骤和环节，每一个步骤和环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件很容易的事，需要病理技术员和医生密切配合，共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。根据我们多年的经验，发现目前，免疫组化制片过程中常见的问题主要有如下几点：
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常见问题 1、组织的前期处理 2、脱片问题 3、阴性片 4、背景染色 Slide 34:
（一） 组织的前期处理要规范固定：新鲜标本一定要及时固定，离体后30min内固定,大标本需切开固定（以防止组织内自溶，抗原被破坏），固定时间不要
超过24小时，以免抗原被封闭，影响结果的表达；固定剂：10%中性甲醛，4%多聚甲醛取材：一般为2×2×0.2cm 脱水、透明要充分
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（二）脱片问题：这是由于玻片处理不当、切片太厚或组织特殊引起。玻片的处理：我们应该将玻片清洗干净。新购买的载玻片用洗衣粉浸泡10小时左右——自来水冲洗干净——蒸馏水冲洗2遍，烤干——浸泡防脱片剂多聚赖氨酸 ——烤干备用。
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多聚赖氨酸的浸泡从公司购买的多聚赖氨酸一般用双蒸水按1:10稀释；每张玻片必须浸泡多聚赖氨酸5min以上,烤干备用；注意已浸泡多聚赖氨酸的玻片应保持干燥，防止长霉
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切片不能太厚，以2-3um为宜，漂片要平整，不能有皱褶、气泡，烤片需60℃，15h以上。对于骨组织和纤维成分较多的组织如乳腺、皮肤特别容易脱片，应特别注意切薄片，最好不超过2um厚，必要时可切片后先做微波1－2min，再烤片，以使组织粘贴牢固。
（三）阴性片染色结果中看不到任何阳性信号，出现这种现象有两种可能：真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。 Slide 39:
假阴性结果：假阴性结果的原因可有： 1、选错蜡块，切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞，因此我们选择蜡块时要注意不要选错。 2、组织未进行抗原修复或修复方法不当，抗原得不到表达，因为有的抗原需热修复，有的需酶消化， 才能表达。 3、一抗失效，二抗、三抗使用不当。
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3、一抗失效，二抗、三抗使用不当。 在购买抗体时，我们要特别注意抗体的匹配问题。我们知道一抗有的来源于鼠,有的来源于兔,因此我们在购买二抗时要注意:对于来源于鼠的一抗,必须购买抗鼠的二抗;对于来源于兔的一抗,必须购买抗兔的二抗才能相匹配，现在许多试剂公司有鼠兔通用的二抗购买，解决了这个问题。
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解决假阴性染色的办法首先 选择正确的蜡块和抗原修复方法，注意抗体的有效期和抗体匹配问题；同时设立“阳性对照”。阳性对照片可以从公司购买，亦可自己准备。如果阳性对照有表达，说明染色过程和试剂无问题。反之，表明染色过程中某个环节或试剂出了问题，应一一寻找原因。
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阳性库的建立对于阳性对照，顺便提一句，作为病理科医生和技术员，我们应善于从平常的工作中收集阳性蜡块，建立自己的阳性对照库，便于随时取来作阳性对照。 具体办法：工作中发现表达很好的组织立即将其蜡块收集起来，集中放入中空干燥器中 ，登记日期、蜡块号码，染色方法，抗原修复方法，阳性抗体名称、购买公司。并存入电脑。
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（四）背景染色 免疫组化除正常的真实阳性信号外，常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色主要有以下几种：
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1、 切片全着色切片全着色是指整个切片都染上颜色(图1)，着色的强度可深可浅，分不清哪些组织是阳性，哪些组织是阴性，出现这种现象的原因有： Slide 46:
1.1、抗体浓度过高，主要是一抗浓度过高，应该在每次使用新的浓缩型抗体之前先做预实验，确定一个最佳浓度。 1.2、一抗变质、抗体孵育时间过长、或者温度过高，因此操作时应注意抗体的有效期，同时严格按照操作规程进行， Slide 47:
1.3、组织变干：抗原修复时修复液溢出后未及时补充液体使组织变干、染色切片太多、动作太慢、 抗体流失等都可造成组织变干 。操作要认真仔细，采用PAP笔画圈，可以有效避免抗体流失，也能提高操作速度。 1.4、DAB 变质或显色时间太长：DAB最好现用现配， 显色在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应 。
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2 、切片边缘着色 切片边缘着色也是一种非常常见的现象，这种现象称为边缘效应 （图2）。产生的原因：
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2.1、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：滴加试剂 应超出组织边缘2 mm。为了避免油剂表面张力的影响，PAP笔画圈时应超过组织边缘3-4 mm。
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2.2、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽 。解决办法：制备优质的多聚赖氨酸玻片，切出尽量薄的组织切片，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死组织块。
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3、切片着色不均匀 是指组织 呈灶片状着色（图3）。 产生这种现象得原因有：
3.1、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，导致显色过深 。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色，周围组织深染。 滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
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3.2、染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。 3.3、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，肽链残段可能与一抗或/和二抗结合导致 着色。 在选择蜡块时应避免选择坏死组织较多的蜡块。
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4、 其他背景染色 4.1、胞浆里含有较多的蛋白质，许多非特异性的染色除了见于间质也可出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。 4.2、因内源性酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、(出自:WwW.HNNscy.Com 博 文学习 网:免疫组织化学)单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），可用过氧化氢进行阻断。 Slide 56:
4.3、内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛存在于组织细胞中，加热抗原修复后亦可造成内源性生物素暴露，而且以颗粒状形式存在于胞浆中，与胞
浆阳性非常相似（图4）。解决办法是 用鸡蛋清封闭或采用非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision）可避免生物素干扰。
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三、 抗体的保存 储存抗体的容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。我们使用的绝大多数抗体都是从公司购买的已稀释的即用型抗体，应保存在4－8℃冰箱中，并注意其有效日期。
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浓缩型抗体 一般应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融，冷冻的抗体溶解时应缓慢地解冻，绝对避免用高温快速解冻。 被细菌污染的抗体会出现假阳性，应防止细菌污染。
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四、病理科建立免疫组化室需要的基本设备 空调； 切片机；漂片烤片机 ；冰箱（4℃.-18℃）；恒温干燥箱； 37℃隔水式恒温箱；微波炉; 高压锅；电磁炉孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架；
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1000ul、100ul、10ul移液器和配套的tip头； PAP油性笔；定时器；放水瓶；错层实验台。免疫组化自动染色仪。
脱落细胞制片技术 :
脱落细胞制片技术 基本程序： 1、编号：申请单、登记本、标本、 玻片 2、登记 姓名、标本来源、临床诊断 3、制片：主要介绍痰液、尿液、胸腹水 标本的制作 4、诊断
一、痰液标本的采集与涂片 :
一、痰液标本的采集与涂片 采集方法：清晨空腹时，先嘱病人将口内唾液吐出，再嘱病人从肺部深处用力咳嗽，咳痰3~6口，总量5ml左右，置于痰杯或厚纸盒内，连续送检3天，每天一次；痰液标本必须新鲜，最好在1小时内涂片固定。
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选材涂片 1、一般选取血丝及其附近；鲜血旁的粘液；灰白、细丝线样痰丝；透明痰液有时也有很多癌细胞。 2、血块、脓块、灰黑色胶冻样颗粒和泡沫等常无癌细胞，选材时应将其除去。 3、涂片：一般涂2张，用细竹签或眼科镊将其拉平或将2张玻片推拉，厚约1mm，不能太厚，也不能太薄。自然凉干或用冷风吹干固定。
二、胸腹水、尿液标本的涂片 :
二、胸腹水、尿液标本的涂片 1、临床送检的胸腹水、尿液标本一般有500ml左右，先将标本静置10分钟，轻轻倒出上清液，保留底部沉淀约20~40ml； 2、将底部沉淀摇匀，加入2支10ml的离心管内（尿液标本需4支离心管），经天平平衡，放入离心机内，以每分钟1000~2000转的速度离心10min; Slide 67:
3、取出离心管，将上清液全部倒去，留0.5ml左右的管底沉淀和剩余液体（尿液标本因细胞少，要尽量吸干上清液将几管的细胞混在一起涂片）； 4、用吸管吸取红细胞与上清液之间的白膜层，置于干净涂片上，每个标本均匀涂片2张，凉干或用冷风吹干固定。
三、涂片制备注意事项 :
免疫组织化学篇二：免疫组织化学
免 疫 组 织 化 学
傅 琦 博
引言
酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。
免疫组织化学概述
免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。
免疫组织化学技术的发展
免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信
号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。
1 利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通过免疫荧光技术首次
从新疆分离到SiN 病毒。1999 年陈振光等利用间接免疫荧光试验检测到福建宁化林区人群、野兔、狐狸、狗存在SiN 感染, 抗体阳性率分别为12. 86%、5. 88%、14. 29%、6. 45%。因而判定福建宁化林区可能存在辛德毕斯热自然疫源地。
2 抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术(A vidin B io t in 2Peroxidase Comp lex technique, 简称ABC 技术) 是H su 等于1981 年创立, 其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。该方法简便、节约时间, 敏感性、特异性高, 背景染色淡。由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力, 可用于双重或多重免疫染色。如李月白等采用ABC 法研究发现绒毛层滋养细胞、绒毛中轴的基质细胞、毛细血管的内皮细胞、毛细血管腔内的淋巴细胞以及血岛细胞均表现为P 物质(SP) 受体免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞膜上, 胞核呈阴性反应。该研究为其对胎盘及胚胎发育的作用提供形态学依据。张雅萍在ABC 法基础之上改进, 建立了生物素- 抗生物素- 过氧化物酶复合物( sABC) 法, 探讨了IL 28 在甲状腺肿瘤组织中的表达及意义。
3 葡萄球菌蛋白A (Staphylococal P ro tein A , SPA 或SP) 具有免疫特性, 发展成为免疫学上一种极为有用的工具。其优点是不受种属特异性的限制, 染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等。故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用。如肖华亮等[9 ]用此法检测、探讨骨肉瘤MDM 2 和p 53 蛋白定位、表达水平及相互关系和其对骨肉瘤转移及预后的影响。应用SPA 与胶体金或铁蛋白相结合, 可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。自Pomano 和Romano (1977) 首次报告用蛋白A -胶体金技术(P ro tein A 2Go ld technique, PGA 技术) 标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以来, SP 法已得到愈来愈广泛的应用, 并发展成为一种较为理想的免疫电镜技术。
4 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法(简称A PAA P 法) 克服了辣根过氧化酶(HRP) 的不足。沈岩等用A PAA P 法结合单克隆抗体(mA b) KL 21 (广谱抗人细胞角蛋白, 德国) 比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。而链霉素亲和素(St rep tavidin, SA ) 具有高度的亲和力, 利用生物素结合的二抗与酶标记的SA 亲和(L SAB 法) 是免疫组化中非常有用的方法。沈靖南等采用该法, 检测84 例骨肉瘤中p2糖蛋白(p 2gp ) 表达, 半定量化计量p2gp 的着色强度及阳性率, 通过多因素相关分析和生存分析, 探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素, 研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后, 并证实p2gp 介导骨肉瘤的MDR 现象, 明确p2gp 表达与肺转移的关系。
5 凝集素( (Phytoagglut in, PHA ) 作为一种探针研究细胞膜上特定的糖基, 具有多价结合能力。直接将标记物标记在凝集素上, 再与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合, 该法简便, 但灵敏性不够高。经研究发现将凝集素直接与切片中的相应糖基结合, 可提高敏感性高5～ 10 倍或更多一些, 有人认为若将凝集素与特定的糖基作成三明治样的糖2凝集素2糖的结合物, 特异性、灵敏度将会更高。而且能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合, 从而在光镜与?或电镜水平显示其结合部位。N ewman 等(1979)以荧光素标记凝集素PHA 实验, 发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。Kivela 和Farkkanen (1987)用凝集素作为细胞特殊类型的标记实验发现, 在人视网膜上PHA 标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PHA 阳性反应, 而肌上皮细胞和间质细胞呈PHA 阴性反应。他以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明, 刀豆素A 和蓖麻素存在于肾脏的各部, PHA 和双花扁豆凝集素(DBA ) 主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞, 荆豆凝集素(U EA ) 主要分布在血管内皮细胞, 而麦芽素分布在肾小球。St reit 和Kreutzberg (1987)发现Griffonia Simp licifo lia 凝集素能特异性标记面神经节内的小胶质细胞, 而其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(A st ro2cyte) 等都显示阴性反应。如果在切断面神经后, 增殖的小胶质细胞对Griffonia Simp licifo lia 凝集素的反应加强。大量研究发现, 凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等(1987)报道115 例胃癌标记PHA 阳性率高达90. 43% , 而正常胃粘膜基本是阴性, 故认为PHA 是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79% , 而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA 可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。HRP 本身虽含有甘露糖, 能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素, 需要将糖基化(Glyco sylat ion) 过氧化物酶结合到该凝集素上, 且糖基化过氧化物酶品种尚有限, 故目前本法在应用还有一定困难。
免疫细胞化学技术尚在继续改进和完善中, 除目前国内外已广泛应用的免疫金技术和免疫金银技术外,
新的免疫细胞化学技术不断出现。1984 年国外学者首次将CRNA 探针应用于原位杂交, 核酸探针为单链的RNA 分子, 产生自具有质粒逆转录系统的cDNA 克隆。在1987 年Wo lf 等建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA 分子, 这种cRNA 分子称为“寡核苷酸核酸探针”(o ligo ribo－p robes) , 现在已被广泛的用于原位杂交实验。国内的杨春花等采用免疫组化和cDNA 2mRNA 原位分子杂交技术分别检测了24 例RA , 18 例骨关节炎(OA ) 和6 例正常滑膜组织中uPA , uPAR 蛋白和mRNA 的分布及表达情况。科研工作者根据免疫组织化学中材料的特性把同位素、生物素、光敏生物素、酶促生物素、地高辛标记cRNA上成功的制成探针。尤其地高辛与放射性标记相比, 标记探针具有非放射性探针的优点, 对人体无害, 不受半衰期限制, 探针可长期保存; 与生物素标记探针相比, 不受组织、细胞中内源性生物素的干扰, 敏感性、分辨率较高, 反应产物颜色鲜艳, 反差好, 背景染色低, 制备探针可较长期保存, 对人体无害等优点,已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。并且进一步研究发现它能根据需要人工用DNA 合成仪合成, 其长度及分子大
小比较一致, 可控地高辛同位素寡核苷酸探针。另外, 放射性同位素、荧光素、生物素也能成功标记寡核苷酸作为探针, 成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些人认为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA 或DNA探针, 但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功, 寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。
免疫细胞化学技术与流式细胞术(FCM ) 结合进行多参数FCM 分析血液淋巴细胞免疫表型(亚群) 方法学因素对实验结果的影响。当血液采集后1h 和6h 测定淋巴细胞免疫表型结果差异无显著。如黄勇华等采用单标或双标直接免疫荧光标记法标记20 种细胞表面分化抗原, 经流式细胞仪测定。后进行分析185 例白血病患者骨髓或外周血白血病细胞的免疫分型及CD117 的表达细胞表面分化抗原(CD) 117 在各型白血病中的表达及其意义。
免疫细胞化学技术先进仪器和方法结合已呈现新的趋势，如用荧光显微分光光度计和图像分析仪等定量检测, 将结果客观打印、报告, 这更适合于临床诊断和科学研究。如杨希谦
等采用非放射碘标记人直肠癌相关抗原单克隆抗体(M cA b)技术与生物导向CT 显像进行肿瘤的免疫组化鉴定与免疫显像研究。
免疫组织化学技术在临床病理诊断中的重要作用
100 年前发明的用光学显微镜观察HE 染色切片法仍然是当前各级医院病理科中的基本方法。该方法的局限性在于仅能从细胞水平反映疾病性质,诊断中观察者的主观推测成份高,常常是同一疾病出现分歧颇大的数个不同诊断,多年来成为临床病理诊断中的突出问题。而免疫组织化学方法是通过抗原抗体反应客观地反映疾病性质,在观察HE 切片基础上,再结合免疫组织化学染色结果可对某一疾病做出较为客观公正的评价,从而可避免主观因素的影响。自免疫组织化学技术应用于临床病理诊断以来,在以下几类疾病的鉴别诊断中发挥着重要作用。
1 高度未分化肿瘤细胞起源的鉴别:发生在胃肠道的这类肿瘤应首选CEA 与Vimentin 两种抗体鉴别是上皮源性抑或是间叶源性肿瘤。因为CEA 在消化道上皮源性肿瘤的阳性率高,但在鳞癌时阳性率低;而消化道以外部位发生者,上皮性标记物宜选用EMA ,该抗体在90 %以上上皮源性肿瘤呈阳性表达。
2 小圆细胞肿瘤的鉴别:小圆细胞肿瘤包括小细胞未分化癌、恶性淋巴瘤、小细胞软组织肉瘤、神经内分泌肿瘤以及小细胞黑色素瘤。这类肿瘤鉴别诊断时应使用EMA 或CEA , LCA , Vimentin , NSE ,S100 和HMB45抗体。
3 大细胞型肿瘤鉴别:这类肿瘤可以是大细胞未分化癌、低分化肉瘤、大细胞性黑色素瘤和大细胞性恶性淋巴瘤。在鉴别诊断时应该选用EMA 或CEA ,Vimentin ,S100 和LCA 抗体。
4 梭形或多形性软组织肉瘤的鉴别:此类肿瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形细胞血管肉瘤、梭形细胞黑色素瘤、多形性横纹肌肉瘤、多形性恶性纤维组织细胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。以下抗体可用于鉴别诊断: Actin , EMA , F ⅧAg , S100 , MB45 ,Myoglobin ,Desmin ,α12AT 以及α12ACT。
5 恶性淋巴瘤分型:在免疫组织化学研究领域，当前对恶性淋巴瘤的免疫组织化学研究最为活跃与细致。截止目前为止,已有下列亚型可以通过免疫组织化学染色确立。它们是:B 细胞淋巴瘤,L26 阳性,LN2 阳性; T 细胞淋巴瘤,MT1 阳性,UCHL1 阳性;N K细胞淋巴瘤C123C 阳性;树突网织细胞淋巴瘤,Ber2MAC2DRC 阳性; 指状突网织细胞淋巴瘤,S100 阳性; 真性组织细胞淋巴瘤, Mac387 阳性,Lysozyme 阳性,α12ACT
阳性; 何杰金病R2S 细胞,LeuM1 阳性,Ber2H2 阳性;大细胞间变型淋巴瘤Ber2H2 (或称Ki21) 阳性。 6 神经内分泌肿瘤的确立:90 %以上的神经内分泌肿瘤NSE 阳性。由于NSE 与其它肿瘤有交叉反应, 故必要时可加染Chromogranin A 或Synaptophysin 抗体。当需要弄清神经内分泌肿瘤有否内分泌功能时,再加染多肽类激素抗体。
7 肿瘤预后的推测:最早用于推测肿瘤预后的抗体有抗雌激素受体ER 及抗孕激素受体PR ,二者阳性时预后较好。新近又发现, 转移抑制基因产物nm23 呈高表达时预后较好。而下列几种抗体呈高表达时均提示预后差：C2erbB22 , C2myc , P53 , EGFR , PCNA , Ki267 , BrdU , P120 , P105。
8 感染性疾病病原体的检测: 其中HBsAg 及HBcAg 抗体常用于肝病研究与诊断。而尖锐湿疣及宫颈癌时常常可以检测到乳头状瘤病毒HPV。鼻咽癌、何杰金病时EB 病毒抗体多呈阳性。
免疫组织化学技术由于它自身独有的特点, 使得广大科研作者在组织细胞定位、定性、定量研究中经常选取的技术, 因此随着科研工具的更新, 科研工作者对免疫组织化学更广泛深入的理解、并与其他研究手段深入结合, 优化技术路线地设计,而推动免疫组织化学技术的进一步发展。如范少地等运用GA
P243cDNA 探针(生长相关蛋白243 (Grow th associated p ro2tein 43, GA P243) 原位杂交技术来观察这一变化过程中GA P243mRNA 表达水平, 阳性细胞定位及分布的变化。李月白等应用免疫组化L SAB 法和原位杂交方法, 观察了骨肉瘤患者p 21w af1?c ip 1 表达水平与临床预后之间的关系。而倪灿荣等应用他们实验室制备的催化信号放大(Catalyzed signal amp lifi2cat ion, CSA ) 试剂应用于IHC 检测50 例10 种不同类型的肿瘤切片中40 种不同的抗原和ISH 检测6 种不同的RNA 成分, 并与常规方法进行敏感性比较: CSA 2IHC 法较传统的PA P 法、ABC 法和L SAB 法敏感500～ 1 000 倍, 较EnV ision 法敏感20～ 100 倍。 参考文献
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免疫组织化学篇三：常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法
( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)
1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。
3.无水酒精Ⅰ 30秒。
4.无水酒精Ⅱ 30秒。
酒精Ⅰ 30秒。
酒精Ⅱ 30秒。
酒精 30秒。
酒精 30秒。
酒精 30秒。
自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)
2O2甲醇处理切片10-20分钟。
水洗。
抗原修复。
洗3次，1分钟/次。
加入血清孵育20分钟。
摔干血清，加入一抗60分钟。
洗3次，2分钟/次。
加入二抗孵育30分钟。
洗3次，2分钟/次。
加入ABC复合物，孵育30分钟。
洗3次，2分钟/次。
2O2孵育切片5-10分钟。
洗，水洗。
苏木素染核5-10分钟。
水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)
切片脱蜡至水。
1 5.95%6.95%7.90%8.80%9.70%10.11.0.3%H12.13.14.PBS15.16.17.PBS1819.PBS20.21.PBS22.DAB-H23.PBS24.Harris25.(1.
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入SP复合物孵育20-30分钟。
洗3次，每次2分钟。
2O2孵育5-10分钟。
洗，水洗。
苏木素染核5-10分钟。
水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。
三)真空负压LSAB法
切片脱蜡至水。
2O2甲醇真空负压处理5min.
水洗。
如果需要，可进行抗原修复。
洗3次，每次1分钟。
加入正常血清真空负压处理5min。
摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5分钟。
洗3次，每次2分钟。
2O2孵育5-10分钟。
洗，水洗。
2 8.PBS9.PBS10.11.PBS12.DAB-H13.PBS14.Harris15.(1.2.0.3%H3.4.5.PBS6.7.8.PBS9.10.PBS11.12.PBS13.DAB-H14.PBS
15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg)
(四)Envision TM Systems.
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
3.水洗。
抗原修复。
洗3次，每次1分钟。
加入一抗体孵育30-60分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入增强剂孵育20-30分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育20-30分钟。
洗3次，每次2分钟。
2O2孵育5-10分钟。
洗，水洗。
苏木素染核5-10分钟。
水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
五)免疫组化双染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method) 切片脱蜡至水。
2O2甲醇处理切片10分钟。
水洗。
抗原修复。
洗3次，每次1分钟。
加入非免疫性动物血清，孵育10分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入第一抗体孵育60分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。
3 4.5.PBS6.7.PBS8.9.PBS10.11.PBS12.DAB-H13.PBS14.Harris15.(1.2.0.3%H3.4.5.PBS6.7.PBS8.9.PBS10.
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。
13.PBS洗3次，每次2分钟。
14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。
15.PBS洗3次，每次2分钟。
16.加入双染增强液，孵育10分钟。
加入非免疫性动物血清孵育10分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。
洗3次，每次2 分钟。
加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入AEC溶液，孵育5-10分钟。
自来水洗。
苏木素染核5-10分钟。
水性封片。
第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。
第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。
六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method) 切片脱蜡至水。
2O2甲醇处理切片10分钟。
水洗。
抗原修复。
洗3次，每次1分钟。
加入选用的第一抗体孵育30-60分钟。
洗3次，每次2分钟。
4 17.18.PBS19.20.PBS21.22.PBS23.24.PBS25.26.27.28.注：1.2.(1.2.0.3%H3.4.5.PBS6.7.PBS
8.加入增强剂孵育20-30分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟
13.PBS洗3次，每次2分钟。
加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入增强剂孵育20-30分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入AEC溶液孵育5-10分钟。
自来水洗。
苏木素染核5-10分钟。
水性封片。
七)细胞培养片免疫荧光染色法。
将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。
纯丙酮固定10分钟。
浸洗3次，每次1分钟。
加入选用的第一抗体孵育120分钟。
洗3次，每次2分钟。
加入荧光抗体孵育60分钟以上。
法3次，每次2分钟。
伊文氏蓝衬染3分钟。
水洗，蒸馏水洗。
水性胶封片或用缓冲甘油封片。
八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。
将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。
5 14.15.PBS16.17.PBS18.19.PBS20.21.22.23.(1.2.3.PBS4.5.PBS6.7.PBS8.0.1%9.10.(1.